Pembiakan Massal Nematoda Entomopatogen

Steinernema Spp.

Oleh: Akhmad Faisal Malik, Romauli Siagian, dan Cecep subarjah

Nematoda entomopatogen (NEP) Steinernema spp. adalah jenis nematoda yang dapat dimanfaatkan untuk mengendalikan serangga hama dan serangga lain yang merugikan. Hal ini dikarenakan kemampuannya menekan populasi serangga hama secara signifikan. Mekanisme infeksi NEP bersimbiosis mutualisme dengan bakteri. Menurut Forst dan Clarke (2002), bakteri simbion memberikan protein anti imun untuk membantu nematoda mengatasi sistem pertahanan inang serta antimikroba asing yang menjadi pesaingnya. Jika tanpa bakteri simbion, nematoda juga dapat mematikan serangga inang, tetapi tingkat reproduksinya rendah. Menurut Hall dan Menn (1984) dalam Wagiman dkk. (2003), NEP juga mampu menghasilkan toksin yang mematikan. Dua faktor ini yang menyebabkan NEP mempunyai daya bunuh yang sangat cepat.

Steinernema spp. memiliki  beberapa kelebihan sebagai agen pengendali hayati, antara lain mempunyai kemampuan mencari inang yang tinggi, bersifat selektif terhadap serangga dengan spektrum inang yang luas, tidak berbahaya bagi mamalia dan vertebrata, kompatibel dengan sebagian pestisida kimiawi, dan mudah dibiakkan secara massal pada media buatan (Chaerani, 2000 dalam Wagiman dkk., 2003). Gaugler dan Kaya (1990) dalam Chaerani dkk. (2001) melaporkan bahwa meskipun Steinernema spp. merupakan organisme hidup di dalam tanah, musuh alami ini juga efektif terhadap hama-hama di atas permukaan tanah, dan sejauh ini belum dilaporkan resistensi serangga terhadapnya dan dampak negatif terhadap jasad bukan sasaran seperti mamalia dan vertebrata.

Steinernema spp. memiliki empat stadia sebelum dewasa, tetapi hanya stadia ketiga yang dapat bertahan di luar serangga inang dan dapat bergerak dari inang yang satu ke inang yang lain. Stadia ketiga ini sering disebut dengan juvenil infektif (JI). Siklus hidup sebagian besar Steinernema mulai dari menginfeksi sampai muncul JI generasi baru berkisar 7-10 hari (Bedding et al.,1993 dalam Wagiman dkk., 2003).

Diagram siklus hidup Steinernema (siklus panjang dan siklus pendek) dengan ilustrasi stadia yang berbeda. G1: generasi pertama, G2: generasi kedua, J1: Juvenil stadia pertama, J2: Juvenil stadia kedua, J3: Juvenil  stadia ketiga (noninfektif), PI: Juvenil stadia prainfektif, IJ: Juvenil infektif stadia ketiga, J4: Juvenil stadia keempat (Sumber: Wouts, 1979 dalam Adams dan Nguyen, 2002)

Steinernema spp. memiliki stadia infektif yang disebut juvenil infektif (JI) yang membawa bakteri simbion di dalam usus. Penetrasi Steinernema ke dalam tubuh serangga dilakukan melalui mulut, anus, dan spirakel untuk menuju haemocol serangga. Beberapa spesies juga dapat melakukan penetrasi melalui membran intersegmental dari kutikula serangga. Namun, Kematian serangga sasaran karena infeksi melalui permukaan kulit lebih lambat dibandingkan dengan infeksi melalui mulut. Keefektifan NEP ditentukan oleh patogenisitasnya. Sedangkan patogenisitasnya dipengaruhi oleh mekanisme infeksi. (Griffin et al., 2005).

Steinernema spp. SEBAGAI AGENS PENGENDALI HAYATI

Meskipun Steinernema spp. secara umum lebih efektif untuk mengendalikan hama di dalam tanah, tetapi aplikasinya melalui penyemprotan pada kanopi tanaman juga sudah dilakukan. Secara umum, eksplorasi Steinernema spp. dapat dilakukan dengan dua cara, yaitu dengan mencari serangga terinfeksi di lapangan dan dengan teknik baiting (baiting method). Namun cara kedua lebih praktis dan efektif karena habitat asli Nematoda entomopatogen berada di tanah. Baik tanah pasir, atau tanah rizosfer tanaman. Eksplorasi Steinernema dengan teknik baiting dilakukan dengan cara sebagai berikut:

Sampel tanah sebanyak kira kira 0,5 kg diambil secara acak pada tempat yang berbeda dengan kedalaman kira kira 0-30 cm, kemudian sampel tanah tersebut dimasukkan ke dalam stoples plastik secukupnya, kira-kira setengah dari stoples. Di atas tanah dalam stoples disebarkan beberapa serangga perangkap berupa ulat hongkong. Sebelum ulat hongkong dimasukkan, tanah di dalam stoples dilembapkan dengan menambahkan air secukupnya untuk memudahkan Steinernema spp. mencari inangnya. Selanjutnya stoples ditutup menggunakan kain kasa agar ulat hongkong tidak keluar dari stoples, kemudian diinkubasikan selama 2-3 hari di tempat gelap. Ulat/larva terinfeksi dipindahkan ke dalam perangkap white yang telah diisi air setinggi kira-kira 0,5 cm dan ditutup kembali agar tidak terinfeksi lalat. Air berisi nematoda dalam perangkap white dipindahkan ke dalam cawan petri atau wadah lainnya. Air di dalam perangkap white selalu diganti dengan air bersih. Pemanenan dilakukan setiap hari hingga sudah tidak terlihat lagi nematoda yang keluar dari tubuh serangga. Selanjutnya, nematoda tersebut diidentifikasi di bawah mikroskop untuk memastikan bahwa nematoda yang didapatkan adalah Steinernema spp.

Eksplorasi Steinernema spp. dengan teknik baiting; serangga perangkap terinfeksi steinernema (tanda panah)

Perangkap white (white trap)

PEMBIAKAN MASSAL

1. Secara in vivo

Pembiakan Steinernema spp. secara in vivo dilakukan dengan menggunakan serangga, baik dengan ulat hongkong (Tenebrio molitor) atau ulat bambu (Galeria melonella). Tahap perbanyakan Steinernema secara in vivo dilakukan sebagai berikut:

Suspensi Steinernema spp. hasil eksplorasi disiapkan. Wadah pembiakan (cawan petri) dialasi dengan dua lapis kertas saring yang dipotong sesuai ukuran alas cawan petri. Ulat hongkong yang telah disebarkan ke dalam cawan petri ditetesi suspensi nematoda yang telah tersedia. Cawan petri ditutup rapat-rapat dan diinkubasikan pada suhu ruangan kurang lebih selama 2-3 hari di tempat gelap. Nematoda dapat dipanen setelah 10-14 hari inokulasi, larva terinfeksi dipindahkan ke dalam perangkap white yang telah diisi air setinggi kira-kira 0,5 cm dan ditutup kembali agar tidak terinfeksi lalat. Air berisi nematoda dalam perangkap white dipindahkan ke dalam ember atau wadah lainnya. Air di dalam perangkap white selalu diganti dengan air bersih. Pemanenan dilakukan setiap hari hingga sudah tidak terlihat lagi nematoda yang keluar dari tubuh serangga. Nematoda hasil panen sudah dapat digunakan untuk pengendalian hama di lapangan.

Pembiakan massal Steinernema secara in vivo

2. Secara in vitro

Keunggulan pembiakan NEP secara in vitro antara dapat bertahan lama, diperoleh nematoda dalam jumlah banyak, dan terjaga dari kontaminasi organisme lain. Tahap pembiakan massal Steinernema secara in vitro sebagai berikut:

• Isolasi bakteri simbion

Bakteri simbion dapat diisolasi dari tubuh Steinernema fase juvenil infektif stadia ke-3 (JI-3). juvenil infektif stadia ke-3 diperoleh dengan menyaring suspensi nematoda menggunakan saringan berukuran 500 mesh. Juvenil infektif stadia ke-3 kemudian disterilkan permukaannya dengan menggunakan larutan hyamine atau formalin 0,1% selama 15-30 menit.  Sebanyak kira-kira 5 atau 10 juvenil diambil menggunakan kait nematoda dan diletakkan di atas obyek gelas steril, kemudian dihancurkan tubuhnya dengan cara menggoreskannya dengan obyek gelas steril yang lain. Juvenil yang telah hancur diambil menggunakan jarum ose dan ditumbuhkan/digoreskan pada media Nutrient Bromthymol Blue Tetrazolium-chloride Agar (NBTA), kemudian diinkubasikan selama 24-48 jam di tempat gelap. Koloni bakteri simbion Xenorhabdus yang tumbuh akan menyerap warna biru (bakteri primer) dan warna merah bata (bakteri sekunder). Koloni bakteri simbion dicirikan dengan bentuk bundar, agak cembung ke atas, dan membentuk alur melingkar yang tegas di bagian tepi koloni. Bakteri simbion kemudian dimurnikan dengan cara digores/streak pada media yang sama, dan diinkubasikan selama 24-48 jam di tempat gelap.

Koloni bakteri Xenorhabdus spp. fase sekunder pada media NBTA (tanda panah)

• Perbanyakan bakteri simbion

Perbanyakan bakteri simbion dilakukan dengan cara mengambil koloni/biakan murni Xenorhabdus spp. menggunakan jarum ose, kemudian diinokulasikan ke dalam media Nutrient Broth (NB) dalam erlenmeyer ukuran 100 ml atau 500 ml. kemudian digojok menggunakan orbital shaker selama 24-48 jam dengan kecepatan 217 rpm di tempat gelap. Selanjutnya, suspensi bakteri dapat digunakan/diinokulasikan pada media buatan.

Koloni bakteri Xenorhabdus spp. yang telah diinokulasikan ke dalam media Nutrient Broth (NB)

Suspensi bakteri Xenorhabdus spp.

• Pembiakan massal

Pembiakan massal Steinernema spp. secara in vitro pada prinsipnya adalah mengembangbiakkan nematoda menggunakan media buatan. Komposisi media buatan yang dapat digunakan berupa 10% Ekstrak ulat hongkong, 10% usus ayam, 10%  lemak sapi, 20% Kaolin, dan 50% akuades steril.

Bahan-bahan tersebut diblender hingga homogen, kemudian diserapkan ke dalam potongan-potongan spon ukuran 1-3 cm³. Dua puluh lima sampai 30 g masing-masing media dimasukkan ke dalam erlenmeyer  volume 500 ml kemudian disterilkan pada suhu 121⁰C, tekanan 1,5 atm selama 30 menit. Media diinokulasi dengan 5 ml biakan bakteri Xenorhabdus fase primer atau sekunder berumur 48 jam dalam media Nutrient Broth. Setelah 24 jam inkubasi dalam keadaan gelap, media diinokulasi dengan suspensi mengandung 2×10³ JI Steinernema yang telah disterilisasi permukaan dengan Hyamine atau formalin 0,1%.

Media buatan untuk perbanyakan massal Steinernema spp. secara in vitro

Nematoda dipanen 2-3 minggu kemudian, dengan cara merendam matriks spons dalam air selama 24-48 jam. Endapan nematoda disaring secara berseri menggunakan saringan berlubang 150, 250, dan 500 mesh, dilanjutkan dengan proses sedimentasi-dekantasi 6-8 kali atau hingga diperoleh nematoda yang bersih dari media. Nematoda hasil panen sudah dapat digunakan untuk mengendalikan hama di lapangan.

DAFTAR PUSTAKA

Adams. J. B. dan Khuong B Nguyen 2002. Taxonomy and Systematics. Pp 1-28 in: Parwinder S. Grewal, Ralf-Udo Ehlers, David I. Shapiro-Ilan (Eds), Nematodes as Biocontrol Agents. CAB International, Wallingford, Oxford.

Animal Diversity Web. 2012. Classification of Steinernema (On line). https://animaldiversity.ummz.umich.edu/site/accounts/classification/Steinernema.html. diakses tanggal 27 Maret 2012

Broadbent dan Olthof, 1995. Foliar Application of Steinernema carpocapsae (Rhabditida: Steinernematidae) to Control Liriomyza trifolii (Diptera: Agromyzidae) Larvae in Chrysanthemums.  Environmental Entomology. Vol. 24:(2) 431-435 Pp.

Chaerani dan Bebet Nurbaeti. 2007. Uji Efektifitas Nematoda Entomopatogen (Rhabditida: Steinernema dan Heterorhabditis) sebagai Musuh Alami Non-endemik Penggerek Batang Padi Kuning (Scirpophaga incertulas). J. HPT Tropika 7(2). Hal. 77

Duryatmo, S. 2005. Kisah Algojo dari Bawah Tanah. Majalah Trubus. 428. 103 hal.

Forst, S. dan David Clarke. 2002. Bacteri-Nematode Symbiosis. Pp 57-73 in: R. Gaugler (Ed), Entomopathogenic Nematology. CAB International, Wallingford, Oxford.

Grewal P. S. dan Peters A. 2005. Formulations and Quality. Pp 47-381 in: Parwinder S. Grewal, Ralf-Udo Ehlers, David I. Shapiro-Ilan (Eds), Nematodes as Biocontrol Agents. CAB International, Wallingford, Oxford.

Griffin et al., 2005. Biology and Behaviour. Pp 47-381 in: Parwinder S. Grewal, Ralf-Udo Ehlers, David I. Shapiro-Ilan (Eds), Nematodes as Biocontrol Agents. CAB International, Wallingford, Oxford.

Ishibashi, N dan Kondo, E. 2000. Behavior of Infective Juveniles. Pp 142. in: R. Gaugler and H. K. Kaya (Eds), Entomopathogenic Nematode in Biological Control. CRC Press, Boca Raton, Florida.

Wagiman, F. X. dkk. 2003. Keefektifan Steinernema spp. terhadap Spodoptera exigua. Jurnal Perlindungan Tanaman Indonesia. 9: 22-27.